快捷导航

　　爱体育,爱体育官网,爱体育APP,爱体育APP下载,爱体育下载,爱体育网页版,爱体育电竞,爱体育百家乐,爱体育百家乐,爱体育真人,CBA直播,CBA最新排名,NBA,NBA排名,NBA联赛,NBA直播

　　胞内菌的治疗是目前临床医疗的难题之一。如结核分枝杆菌、沙门伤寒菌、嗜肺军团菌等胞内菌，它们通常寄生在人体吞噬细胞内，往往会对人体造成慢性持续性感染。当这些病菌侵染人体后会被吞噬细胞吞噬，但吞噬细胞不能像裂解大肠杆菌等非胞内菌那样将其杀死。例如胞内菌中的结核分枝杆菌已演化出了逃逸吞噬细胞裂解的机制，它通过阻止其所在吞噬泡的酸化进程，来阻止吞噬泡与溶酶体的融合。这样结核分枝杆菌就能长期寄生在胞内，并在人体免疫能力下降时侵染周围细胞。胞内菌的治疗主要是用抗生素等抗菌药长期疗法，大多数的抗生素等抗菌药治疗胞外菌疗效好，但它们很难进入细胞内或入胞浓度低难以杀死胞内寄生菌，并且长期用药也容易产生耐药菌。为探索解决胞内菌的治疗难题，本研究利用毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶，并利用该酶具有的甘露糖残基是巨噬细胞表面甘露糖受体的配体这一特点，研究利用巨噬细胞受体与配体之间的相互作用介导甘露糖化人溶菌酶内吞，以达到杀死寄生在巨噬细胞内病菌的目的。巨噬细胞等吞噬细胞是人体的固有免疫细胞，它们构成人体的第二道防线。巨噬细胞能通过细胞表面受体来识别入侵机体的病原体，在众多的表面受体中，甘露糖受体是重要的病原体模式识别受体之一。巨噬细胞能通过甘露糖受体的介导作用，将带有甘露糖糖链修饰的病原体内吞到胞内。因此利用甘露糖残基修饰的药物靶向巨噬细胞是一条值得探索的药物递送途径。巴斯德毕赤酵母表达系统是成功的蛋白分泌表达系统之一，该系统能对蛋白进行多种翻译后加工修饰，如能特异性在NXS/TX为除脯氨酸以外的所有氨基酸位点的天冬酰胺上进行外侧链为甘露糖残基的糖基化修饰。利用毕赤酵母的这一特性，可以使具有N糖基化位点的蛋白进行甘露糖化修饰。人溶菌酶具有水解细菌肽聚糖层中N乙酰胞壁酸与N乙酰葡糖胺之间的Β14糖苷键能力，它能杀死革兰氏阳性菌，在体内的补体的帮助下对革兰氏阴性菌也有一定的抑杀作用，因此具有潜在的药用价值。但是天然的人溶菌酶没有N糖基化位点，理论上用毕赤酵母表达该蛋白也不会产生N糖基化修饰。为获得甘露糖化修饰的人溶菌酶及对其相关特性的研究，本实验从以下几个方面进行1、利用毕赤酵母表达甘露糖化修饰的人溶菌酶突变体本研究得到C端融合2个N糖基化位点序列的人溶菌酶突变体的融合基因，并以此构建了PPICZΑAHLYZMYCHIS载体，将该载体转化毕赤酵母GS115菌株。得到重组菌分泌表达的蛋白通过SDSPAGE分析显示为一弥散的条带，弥散蛋白相对分子质量MR位于2045KDA之间。取其中MR最小的带做肽指纹图谱分析，结果该重组蛋白的氨基酸序列与人源溶菌酶LYSOZYMEPRECURSOREC32117的氨基酸重合率达36％；WESTERN印迹表明弥散的重组蛋白均能与鼠抗人溶菌酶单克隆抗体特异性结合；重组蛋白经过PNGASEF酶切分析，SDSPAGE显示弥散条带消失，在理论MR附近出现一条分子量均一的条带；用伴刀豆蛋白ACONA对该重组蛋白进行检测，结果表明该重组蛋白可以与CONA特异性结合。以上结果表明得到的重组蛋白为甘露糖化修饰的人溶菌酶。2、甘露糖化修饰的人溶菌酶可以被巨噬细胞内化通过构建人溶菌酶与增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的融合基因载体PPICZΑAHLYZ/EGFP，电转GS115构建重组菌GS115/PPICZΑAHLYZ/EGFP，该重组菌诱导表达重组融合蛋白，通过硫酸铵沉淀、G25柱脱盐、镍亲和层析纯化获得目的重组融合蛋白，脱去咪唑与盐后冻干浓缩，将该重组融合蛋白与RAW2647细胞共孵育，用激光共聚焦显微镜观察，发现有绿色荧光物质进入RAW2647，而在有甘露糖竞争性配体甘露聚糖存在时，观察不到有绿色荧光物质进入RAW2647细胞。此现象说明甘露糖化人溶菌酶能进入巨噬细胞且这一过程是由甘露糖受体介导的。3、低甘露糖化糖基酵母工程菌GJK05表达人溶菌酶及其活性鉴定通过构建PPICZΑAHLYZ载体及用作对照的载体PPICZΑAHLYZN/Q，电转化低糖基化酵母工程菌及GS115菌株，分别构建重组菌表达重组蛋白HLYZ及HLYZN/Q。用伴刀豆蛋白ACONA检测重组蛋白的甘露糖化修饰；平板抑菌圈法比较重组人溶菌酶的活性，发现GS115表达高甘露糖化的重组人溶菌酶影响了其抑菌的活性。低糖基化酵母工程菌GJK05表达的重组人溶菌酶与RAW2647进行免疫荧光实验，激光共聚焦显微镜可观察到RAW2647细胞内有荧光物质。综上述本研究获得了具有活性的甘露糖化的重组人溶菌酶，该重组蛋白具有体外抑菌活性，并且能够在巨噬细胞表面的甘露糖受体的介导下进入巨噬细胞，为进一步研究甘露糖化人溶菌酶的胞内抑菌活性奠定基础。